МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

Республиканский Центр Государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства здравоохранения Республики Узбекистан

Санитарно-эпидемиологическая станция Медико-санитарного объединения

Научно-исследовательский институт Санитарии, гигиены и профессиональных заболеваний Министерстве здравоохранения Республики Узбекистан

«УТВЕРЖДАЮ»

Главный Государственный

санитарный врач

Республики Узбекистан

___________ С.С. Саидалиев

«___» _____________ 20___г.

ПОРЯДОК ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ (ГМО) В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ И ПРОДОВОЛЬСТВЕННОМ СЫРЬЕ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ (ПЦР)

(методическое руководство)

Ташкент. 2016 год.

УЧРЕЖДЕНИЯ – РАЗРАБОТЧИКИ:

Республиканский Центр Государственного санитарно-эпидемиологического надзора Министерства здравоохранения Республики Узбекистан

Санитарно-эпидемиологическая станция Медико-санитарного объединения при Министерстве здравоохранения Республики Узбекистан

Научно-исследовательский институт санитарии, гигиены и профессиональных заболеваний Министерства здравоохранения Республики Узбекистан

СОСТАВИТЕЛИ:

- Сатвалдиев А.М.	- заведующий отделом контроля выдачи санэпид заключений РесЦГСЭН МЗ РУз
- Джемилева С.Ф.	- заведующая вирусологической лабораторией РесЦГСЭН МЗ РУз, к.м.н.
- Плешков Б.А.	- врач-вирусолог вирусологической лаборатории РесЦГСЭН МЗ РУз
- Эшназаров С.Э.	- врач-бактериолог бактериологической лаборатории СЭС МСО при МЗ РУз
- Наврузов Э.Б.	- старший научный сотрудник НИИ СГПЗ МЗ РУз

РЕЦЕНЗЕНТЫ:

- Худайберганов А.С.	- главный специалист Министерства здравоохранения по гигиене питания, д.м.н., профессор
- Нуралиев Н.А.	- заведующий лабораторией гигиены воды, почвы и санитарной микробиологии НИИ СГПЗ МЗ РУз, руководитель проекта АДСС-15.17.4, д.м.н., профессор
- Шукуров А.Н.	- заместитель главного врача РесЦГСЭН МЗ РУз по санитарным вопросам, к.м.н.

Методическое руководство рассмотрено и одобрено на заседании Комитета по гигиенической регламентации потенциально неблагоприятных факторов окружающей среды при Минздраве РУз (протокол № 5 от 09.09.2016 года)

Методическое руководство разработано во исполнении плана мер по внедрению нормативно-правовых и организационных механизмов регистрации, учета и проверки импортируемых и производимых в республике продовольственных товаров с содержанием генетически модифицированных организмов (ГМО), утвержденные протоколом заседания Республиканской Комиссии по организации и контролю за реализацией комплекса мер в области здорового питания республики Узбекистан за №1-3331от 05.02.2016г., в целях установления единого методического подхода для контроля генетически модифицированных организмов в готовых пищевых продуктах, а также в сырье, используемом для производства пищевых продуктов.

Методическое руководство предназначено для применения в лабораториях санитарно-эпидемиологической службы Республики Узбекистан для контроля безопасности пищевой продукции.

Содержание

1. Список терминов.

2. Введение.

3. Сущность метода.

4. Требования к помещениям и техника безопасности.

5. Оборудование и материалы.

6. Отбор, хранение и подготовка образцов пищевых продуктов для анализа.

7. Порядок проведения исследований.

8. Интерпретация результатов.

9. Утилизация отходов.

10. Источники появления ложноположительных результатов при проведении ПЦР-анализа и их предотвращение.

11. Приложение 1. Алгоритм лабораторного исследования образца пищевой продукции.

12. Приложение 2. Схема лабораторного исследования образца пищевой продукции.

13. Приложение 3. Бланк протокола лабораторных исследований на содержание (определение количества) генетически модифицированных организмов (ГМО) в пищевых продуктах.

14. Литература.

1.Список терминов.

Ген - (от греч. genos - род, происхождение), фрагмент молекулы ДНК, ответственный за какой-либо признак живого организма.

Генетическая конструкция – генно-инженерная последовательность ДНК, вносимая в геном организма, обычно один или несколько генов, регуляторные последовательности (промоторы и терминаторы) и маркерные гены.

Генетически модифицированный организм (ГМО) – это организм, генетический материал (ДНК) которого был изменен таким образом, как это не может произойти в природе, т.е. методами генной инженерии.

Маркерные гены – гены, позволяющие отделить генетически модифицированные организмы от организмов, не подвергнутых генетической модификации.

Промотор (от лат. promoveo - продвигаю) - последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, ответственная за начало транскрипции. Наиболее распространенные промоторы 35SCaMV, NOS, adh, act

Терминатор - последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК, ответственная за прекращение транскрипции. Наиболее распространенные терминаторыNOS, 35SCaMV, E9, osc

Транскрипция - (от лат. transcriptio - переписывание), биосинтез РНК на матрице ДНК; первая стадия реализации передачи генетической информации.

Трансформационное событие – уникальное сочетание генетической конструкции и геномной ДНК организма, однозначно характеризующее место встраивания генетической конструкции в геном генетически модифицированного организма. Определяет линию ГМО.

2.ВВЕДЕНИЕ

В последние десятилетия разработка рядом зарубежных стран и транснациональными компаниями (ТНК) новых и совершенствование имеющихся методов молекулярно-генетического изучения геномов живых организмов способствует активному развитию в мире биотехнологий. Одним из результатов этой активности является получение и широкое распространение в мире генномодифицированных организмов (ГМО).

С начала выращивания в мире биотехнологических культур с 1996 по 2014 гг. площади, занятые ГМ-культурами, выросли более чем в 100 раз (с 1,7 млн. до 181,5 млн. га, или более 13% всех мировых посевных площадей), а количество потребленных за указанный период пищевых продуктов, содержащих ГМ-ингредиенты, составило 1 трлн. тонн. Такие растения выращиваются в 27 государствах, из которых 19 являются развивающимися, а 8 - промышленно развитыми странами. Мировым лидером в этой сфере являются США, за ними следуют Бразилия, Аргентина, Индия, Канада и КНР.

Тем временем, эксперты во всем мире «бьют тревогу». По их мнению, дальнейшее подчинение науки коммерческим интересам транснациональных корпораций может поставить под угрозу здоровье миллионов людей. В частности, еще в 2000г. было опубликовано Мировое заявление ученых об опасности генной инженерии, а затем и их Открытое письмо правительствам всех стран о введении моратория на распространение ГМО, подписанное 828 учеными из 84 стран мира. В свою очередь, в 2008 г. ООН и Всемирный банк впервые осудили крупный бизнес и генетически модифицированные технологии. В докладе, в подготовке которого участвовало около 400 специалистов, говорится о том, что использование в сельском хозяйстве генетически модифицированных технологий не решает проблемы голода и представляет угрозу здоровью населения и будущему планеты.

Кроме того, ежегодно, с 2000 г. в более чем 400 городах свыше 50-ти стран мира 8 апреля в Международный день действий против генетически модифицированных продуктов и организмов проходят массовые акции протеста, в которых участвуют более 2 млн. человек. В 2009г. члены старейшей в США Американской Академии экологической медицины потребовали объявить в стране мораторий на использование ГМО и призвали ученых отслеживать их влияние на здоровье людей. Для населения других стран это заявление американских врачей было очень важно, поскольку США являются основным поставщиком ГМО. В заявлении говорится: «Следуя принципу предосторожности, учитывая, что генетически модифицированные продукты не были соответствующим образом проверены на безопасность для человека, и, в связи с наличием явных свидетельств возможного вреда, Академия просит врачей обучать широкую общественность, как избегать ГМ-продуктов, сообщать о рисках для здоровья, связанных с их употреблением и объявить мораторий, проводить долгосрочные независимые исследования на безопасность ГМО.

Государственной программой «Год здоровой матери и ребенка», утвержденной Постановлением Президента Республики Узбекистан от 9 февраля 2016 г. №ПП2487 предусмотрено внесение поправок в Закон Республики Узбекистан «О качестве и безопасности пищевой продукции», направленных на ограничение ввоза и потребления продовольственных товаров, содержащих генетически модифицированные организмы, а так же введения запрета на применение ГМО в детском питании.

В соответствии с планом мер по внедрению нормативно-правовых и организационных механизмов регистрации, учета и проверки импортируемых и производимых в республике продовольственных товаров с содержанием генетически модифицированных организмов (ГМО), утвержденные протоколом заседания Республиканской Комиссии по организации и контролю за реализацией комплекса мер в области здорового питания республики Узбекистан от 05 февраля 2016г. №1-3331, Министерству здравоохранения, совместно с Агентством Узстандарт поручена актуализация межгосударственных методов (ИСО) качественного определения ГМО в пищевой продукции и укомплектования лабораторий санитарно-эпидемиологической службы необходимым оборудованием, вносятся соответствующие дополнения в СанПиН 0283 «Гигиенические требования к безопасности пищевой продукции» с включением содержания ГМО в пищевой продукции к критериям безопасности.

В связи с чем, на основе гармонизации ГОСТ ИСО 21569-2009 - «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов в производных продуктов. Методы качественного обнаружения на основе анализа нуклеиновых кислот»; ГОСТ ИСО 21570-2009 - «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте»; ГОСТ ИСО 21571-2009 - «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Экстрагирование нуклеиновых кислот» предлагается методическое руководство .

3. Сущность метода.

Метод основан на следующих стандартах: ГОСТ ИСО 21569-2009 - «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов в производных продуктов. Методы качественного обнаружения на основе анализа нуклеиновых кислот»; ГОСТ ИСО 21570-2009 - «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте»; ГОСТ ИСО 21571-2009 - «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производных продуктов. Экстрагирование нуклеиновых кислот»; ГОСТ Р ИСО 21571-2014 - «Продукты пищевые. Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Экстракция нуклеиновых кислот».

Диагностика генетически модифицированных растений и животных позволяет выявить измененный ген, с целью получения нового признака или генной инженерии ДНК растения, что недостижимо для данного организма с помощью селекции.

При конструировании часто используются селективные гены: это регуляторные и маркерные векторные последовательности, свидетельствующие о произведенных генетических модификациях.

Генетическая конструкция при создании генетически модифицированных организмов обязательно включает в себя промоторную область, определяющий новое свойство, терминаторную область или изменения самого гена. Приблизительно 92% от всех генетически модифицированных линий сои и кукурузы можно обнаружить в ГМ-продуктах с помощью методов детекции 35S-промотора. При параллельном исследовании продукта на наличие терминатора, вероятность выявить наличие ГМО достигает 98%.

Изучение ДНК-технологии, находящейся в основе создания ГМО, привело к разработке специфичных и чувствительных методов их детектирования.

Метод выявления ГМО в сырье и пищевых продуктах растительного происхождения основана на использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией результатов в режиме реального времени.

Метод ПЦР в реальном времени основан на детектировании сигнала флуоресценции, позволяющем наблюдать процесс накопления продукта в процессе реакции. Сигнал флуоресценции нарастает пропорционально увеличению количества продукта амплификации в исследуемом образце.

Момент заметного увеличения сигнала и отрыв его от базовой линии, так называемый пороговый цикл, зависит от исходного количества ДНК-мишени. Чем больше количество ДНК в образце, тем раньше наблюдается начало роста сигнала флуоресценции и тем меньше пороговый цикл.

3.1. Качественное определение ГМО

Качественное определение ГМО основано на идентификации генетически модифицированных (ГМ) регуляторных последовательностей 35S-промотора и NOS-терминатора. Набор реагентов для обнаружения ДНКГМО (35S-промотор, NOS-терминатор) применяется при скрининговых исследованиях пищевой продукции, полученной из/или с использованием сырья растительного происхождения, имеющего ГМ аналоги (приложение 1).

При использовании данного набора реагентов одновременно в одной пробирке проходит три независимых реакции. Одна реакция позволяет обнаружить фрагмент ДНК 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (CaMV), который присутствует во всех известных и выращиваемых в промышленных масштабах ГМ растениях. Другая реакция позволяет обнаружить фрагмент ДНК NOS терминатора T1 плазмиды Agrobacterium tumefaciens, который также присутствует во многих промышленно выращиваемых ГМ растениях. Наличие положительной динамики для одной или обеих реакций говорит о наличии в образце ДНК ГМ растения. Третья реакция – реакция внутреннего положительного контроля ( ВПК) – позволяет исключить ложноотрицательные результаты. Положительная динамика по реакции ВПК, в случае отсутствия положительной динамики по двум другим реакциям, подтверждает отсутствие ДНК ГМ растения в образце. Протекание каждой из трех реакций детектируется с помощью специфического зонда, меченного заданным флуоресцентным красителем. Для обнаружения NOS терминатора используется зонд, меченный красителем FAM, для 35S промотора – красителем ROX, а для ВПК – красителем Cy5.

3.2. Количественное определение ГМО

Количественное определение ГМО растительного происхождения основано на расчёте отношения количества ДНК определенной линий ГМ растения к общему количеству ДНК анализируемого растения, выраженного в процентах.

В каждой тест-системе для количественного определения ГМО одновременно проводятся две независимые реакции в одной пробирке.

Одна реакция позволяет обнаружить ДНК анализируемого растения (соя, кукуруза и т.п.). Другая реакция позволяет обнаружить последовательность, специфичную для конкретной линии ГМ растения. Протекание каждой реакции детектируется с помощью специфического зонда. Для обнаружения ДНК анализируемого объекта (соя, кукуруза) используется зонд, меченный красителем R6G, а для обнаружения генетической вставки – красителем FAM или ROX в зависимости от типа прибора.

Определение процентного содержания ГМО происходит с использованием калибровочных образцов (КО), которые представляют собой смеси ДНК растения дикого типа (0 % ГМО) и ДНК ГМ линии (100 % ГМО) в определенном процентном соотношении. Разность значений пороговых циклов двух реакций для калибровочных образцов используется для построения калибровочной прямой. С помощью калибровочной прямой рассчитывается процентное содержание ДНК ГМО в анализируемых образцах.

3.3. Этапы определения ГМО

Качественное и количественное определение ГМО в пищевых продуктах растительного происхождения с помощью метода ПЦР состоит из следующих этапов:

- подготовка проб,

- выделение ДНК из исследуемого образца,

- проведение ПЦР в реальном времени,

- анализ полученных данных с помощью программного обеспечения прибора,

- обработка результатов с помощью программы Excel и документирование.

Схема проведения анализа представлена в приложении 2.

4. Требования к помещениям и техника безопасности

4.1. Общие требования

4.1.1. Общее расположение лаборатории, а также ее инфраструктура должны соответствовать Инструкции «III-IVгуруҳ бактериялари ва вируслари билан ишлаш, уларни ҳисобга олиш, сақлаш, ташиш ва бошқа ташкилотга бериш», за № 012-3/0195 от 07.01.2011г., утверждённой Главным Государственным санитарным врачом Республики Узбекистан.

4.1.2. Организационные вопросы по проведению исследований на ГМО должны соответствовать требованиям Приказа Министерства здравоохранения Республики Узбекистан за №337 от 10.11.2009г. «Об утверждении методических рекомендаций о положении лабораторий, применяющих иммуноферментный анализ (ИФА) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР)».

4.1.3. Исследования по выявлению ГМО растительного происхождения могут проводиться на базе лабораторий, проводящих исследования методом ПЦР с патогенными биологическими агентами. В таком случае должно быть предусмотрено разграничение проведения исследований во времени.

4.2. Требования к персоналу

4.2.1. Персонал, проводящий качественное и количественное определение ГМО растительного происхождения методом ПЦР-РВ должен пройти соответствующее обучение.

4.3. Правила работы для персонала

4.3.1. Для сотрудников лаборатории должна быть предусмотрена спецодежда: медицинский халат, шапочка, перчатки и сменная обувь.

4.3.2. На каждом этапе ПЦР исследования необходимо использовать индивидуальный набор соответствующего лабораторного оборудования, расходных материалов и одежды.

4.3.3. Одноразовые перчатки подлежат смене при каждой новой операции. Работа без перчаток запрещена.

4.3.4. Запрещается перемещать личные вещи, лабораторные журналы, лабораторную одежду и канцелярские принадлежности между зонами лаборатории.

4.4. Правила работы с оборудованием

4.4.1. Все лабораторное оборудование, в том числе пипетки, штативы, лабораторная посуда, а также все рабочие растворы должны быть строго стационарными. Запрещается их перенос из одного помещения в другое.

4.4.2. Перед началом работы рабочую поверхность столов обрабатывают 70% этиловым спиртом и облучают ультрафиолетовым излучениемне менее 10 минут.

4.4.3. Для того чтобы избежать аэрозольного загрязнения пипеток, использовать только наконечники с антиаэрозольными барьерами.

4.4.4. Во время проведения манипуляций на встряхивателе (вортексе) штативы для наконечников должны быть закрыты крышками.

4.4.5. По окончании работ рабочие поверхности, дозаторы, встряхиватель, термостат, центрифугу обрабатывают растворами, вызывающими деградацию ДНК (например, 3% раствором хлорамина, 0.1% растворДП-2Т с экспозицией 30 минут, с последующей протиркой влажными тампонами для снятия остатков дезинфицирующего средства) и облучают ультрафиолетовым излучением не менее 10 минут.

4.4.6. Пробирки с продуктами ПЦР и использованные наконечники к микродозаторам подвергаются первичной обработке растворами, вызывающими деградацию ДНК.

5. Оборудование и материалы.

5.1. ЗОНА 1. Этап выделения ДНК из исследуемого материала:

5.1.1. ПЦР-бокс (например, БАВ-ПЦР "Ламинар-С" фирмы «Ламинарные системы», Россия) или отдельный стол, освещаемый УФ-лампой.

5.1.2. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» на 25-100^оС (например, «Циклотемп-501», фирмы СТМ-Ц, Россия).

5.1.3. Микроцентрифуга для пробирок со скоростью вращения 10000-16000 об./мин. (до 12000 g) (например, «Циклотемп-201», фирмы СТМ-Ц, Россия).

5.1.4. Микроцентрифуга-встряхиватель со скоростью вращения не менее 3500 об./мин. (до 2500 g) и со сменными роторами для пробирок на 1,5 и на 0,2 мл (например, «Циклотемп-901», фирмы СТМ-Ц, Россия).

5.1.5. Отдельный набор автоматических пипеток переменного объема на 2-20, 20-200, 100-1000 мкл (например, фирмы «BIOHIT», Финляндия).

5.1.6. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, фирмы«Axygen», США).

5.1.7. Одноразовые полипропиленовые плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл типа «Эппендорф» (например, фирмы «Sarstedt», Германия).

5.1.8. Штативы для микропробирок на 1,5 мл (например, фирмы «Хеликон», Россия).

5.1.9. Холодильник с отделениями на 2-8оС и на -18 - -20^оС.

5.1.10. Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.

5.1.11. Пинцеты медицинские.

5.1.12. Ножницы медицинские.

5.1.13. Скальпели хирургические.

5.1.14. Ступки фарфоровые с пестиком.

5.2. ЗОНА 2. Этап амплификации ДНК (метод ПЦР-РВ) и анализ результатов:

5.2.1. Прибор для ПЦР в реальном времени (например, «АНК-32», ИАнПРАН, Россия).

5.2.2. ПЦР-бокс или отдельный стол, освещаемый УФ-лампой (например, БАВ-ПЦР "Ламинар-С" фирмы «Ламинарные системы», Россия).

5.2.3. Микроцентрифуга-встряхиватель со скоростью вращения не менее 3500 об./мин. (до 2500 g) и со сменными роторами для пробирок на 1,5 и на 0,2 мл (например, «Циклотемп-901», фирмы СТМ-Ц, Россия).

5.2.4. Автоматическая пипетка переменного объема 0.5-10 мкл (например, фирмы «BIOHIT», Финляндия).

5.2.5. Штативы для микропробирок на 0,2 мл (например, фирмы «Хеликон», Россия).

5.2.6. Одноразовые наконечники для пипеток переменного объема саэрозольным барьером до 10 мкл (например, фирмы «Axygen»,США).

5.2.7. Холодильник с отделениями на 2-8оС и на -18--20^оС.

Допускается использование аналогичного оборудования, не уступающего по характеристикам указанному выше.

6. Отбор, хранение и подготовка образцов

пищевых продуктовдля анализа

Отбор проб проводят по государственным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции.

6.1. Отбор образцов продуктов

6.1.1. От партии сырья или сыпучих продуктов отбирают общую пробу следующим образом:

- от исследуемой партии сырья или сыпучих продуктов отбирают не менее 10 образцов проб (по 5-10 г) в одноразовый плотный полиэтиленовый пакет с использованием одноразовых хирургических перчаток и перемешивают, формируя общую пробу (50-100 г);

- из общей пробы отбирают среднюю пробу массой 10-20 г, помещают в полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией размером не более 10х15 см, который, в свою очередь, помещают в одноразовый плотный полиэтиленовый пакет размером 20х30 см, опечатывают и отправляют на анализ.

6.1.2. От партии продуктов плотной консистенции отбирают общую пробу массой 10-50 г в одноразовый плотный полиэтиленовый пакет с застежкой-молнией размером не более 10x15 см, используя одноразовые перчатки и фламбированные (выдержанные в 96% этаноле и обожженные в пламени газовой горелки) инструменты, опечатывают и отправляют на анализ.

6.1.3. Пробы жидких продуктов отбирают в чистые емкости из стекла или пластика с герметично закрывающимися крышками объемом не более 50 мл, опечатывают и отправляют на исследование.

6.2. Подготовка образцов продуктов к анализу

6.2.1. Для подготовки проб необходимо использовать одноразовые полипропиленовые пробирки, ступки и пестики, предварительно обработанные хромовой смесью и фламбированные инструменты - пинцеты, скальпели, ножницы.

6.2.2. Пробы сухих гранулированных и сыпучих продуктов отбирают в ступку по 5-10 г и растирают пестиком до гомогенного состояния.

Для анализа необходимо 50 – 150 мкг образца.

6.2.3. Пробы плотных продуктов (сырых или подвергшихся кулинарной обработке) весом 5-10 г помещают в ступку, измельчают ножницами, затем растирают пестиком до гомогенного состояния. Для анализа необходимо 50 – 150 мкг образца.

6.2.4. Пробы продуктов консистенции крахмала массой 100-300 мг помещают в одноразовые пластиковые пробирки и добавляют 1.0 мл физиологического раствора. Для анализа необходимо 50 – 150 мкл образца.

6.2.5. Пробы жидкой консистенции отбирают автоматическими пипетками содноразовыми наконечниками в одноразовые пробирки из полипропилена. Для анализа необходимо 50 - 150 мкл образца.

6.3. Хранение и транспортирование проб

6.3.1. Образцы сырья и продуктов рекомендуется хранить в течение 1 месяца (при необходимости повторного анализа) согласно условиям, указанным производителем продукта питания.

6.3.2. Образцы скоропортящихся продуктов рекомендуется хранить в замороженном состоянии (при температуре минус 20^оC) в течение 1 месяца (при необходимости повторного анализа).

6.3.3. Транспортирование образцов осуществляют при температуре, рекомендованной для хранения сырья или пищевого продукта.

Длительность транспортирования не должна превышать сроков годности продукта.

7. Порядок проведения исследования

7.1. Выделение ДНК из образцов продуктов

При этом используется набор реагентов для выделения ДНК из растительного сырья, продуктов питания и кормов на 50 выделений

Состав набора

- Инструкция - 1 экземпляр

- Реагент № 2 – Лизирующий буфер, 40 мл – 1 флакон

- Реагент № 3 – Протеиназа К, 0,9 мл – 1 пробирка

- Реагент № 4 – Буфер для сорбента, 10 мл – 1 флакон

- Реагент № 5 – Сорбент, 1,1 мл – 2 пробирки

- Реагент № 6 – Промывочный раствор А, 15 мл – 1 флакон

- Реагент № 7 – Промывочный раствор Б, 50 мл – 1 флакон

- Реагент № 8 – ТЕ-буфер, 6 мл – 1 флакон

Условия доставки.

Набор доставляется без охлаждения и далее хранится в соответствии с условиями хранения

Условия хранения

Реагенты № 2, 4-8 при температуре + 4-8 ºC

Реагент № 3 при температуре - 18 - -20ºC

Срок годности

12 месяцев при соблюдении условий хранения

Дополнительное оборудование

1. Центрифуга для микропробирок 13 000 об/мин,

2. Микропробирки объемом 1,5 или 2,0 мл,

3. Микропипетки переменного объема на 1000, 200 и 20 мкл и наконечники к ним,

4. Штатив для пробирок 2,0 мл,

5. Термостат твердотельный, например, «Циклотемп-303»

6. Микроцентрифуга-встряхиватель, например, «Циклотемп-901»,

7. Шпатели

8. Весы, дискретность не менее 0,01 г

Подготовка реагентов

Реагенты №2, №4 и №6 (если есть осадок) прогреть на термостате при 60 ^оС или выдержать при комнатной температуре 15-30 минут и обязательно перемешать плавным переворачиванием до полного растворения осадка.

Навеска

- Сухие однородные образцы – 50-60 мг

- Сухие неоднородные образцы, образцы сложного состава (чем более неоднородный образец, тем большая навеска необходима) – 50-100 мг

- Влажные образцы – 50-200 мг

- Жидкие образцы – 100-300 мкл

Протокол выделения стандартный

1. Измельченные навески образцов перенести в одноразовые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл или 2,0 мл. Дополнительно в каждой серии выделений приготовить пустую пробирку для ОКО-В.

2. Внести в каждую пробирку (включая ОКО-В) по 800 мкл Реагента №2 и 15 мкл Реагента №3. Тщательно перемешать на вортексе или с помощью стеклянной палочки.

3. Инкубировать смесь 30 минут при температуре +60^оС, периодически перемешивая на вортексе (каждые 5-10 минут). Остудить пробирки (1-2 минуты) и центрифугировать смесь 5 минут при 12-14 тыс. об/мин.

4. Во время лизиса и центрифугирования приготовить Осаждающий Реагент. Для этого в новые пробирки на 1,5 мл, взятые в количестве, равном количеству Ваших образцов, внести по 200 мкл Реагента №4 и по 40 мкл Реагента №5 (Реагент №5 непосредственно перед внесением интенсивно перемешать на вортексе до полной гомогенизации).

5. После лизиса и центрифугирования верхнюю водную фазу из каждой пробирки с образцами в объеме 300 мкл (при недостатке можно отбирать меньше – до 100 мкл) очень аккуратно, не захватывая нижний слой и не осевшие частицы, перенести отдельными наконечниками саэрозольными барьерами в пробирки с Осаждающим Реагентом.

6. Интенсивно перемешать пробирки на вортексе до полного ресуспензирования сорбента. Инкубировать при комнатной температуре 10 минут, периодически встряхивая пробирки. Центрифугировать пробирки с суспензией при 7 тыс. об/мин 1 минуту. Удалить супернатант, используя отдельный наконечник для каждой пробы.

7. Добавить к осадку в каждой пробирке по 300 мкл Реагента №6. Интенсивно перемешать на вортексе до полного ресуспензирования сорбента. Центрифугировать пробирки с суспензией при 7 тыс. об/мин 30секунд. Удалить супернатант, используя отдельный наконечник для каждой пробы.

8. Добавить к осадку в каждой пробирке по 500 мкл Реагента №7. Интенсивно перемешать на вортексе до полного ресуспензирования сорбента. Центрифугировать пробирки с суспензией при 7 тыс. об/мин 30секунд. Удалить супернатант, используя отдельный наконечник для каждой пробы.

9. Добавить к осадку в каждой пробирке еще по 500 мкл Реагента №7. Интенсивно перемешать на вортексе до полного ресуспензирования сорбента. Центрифугировать пробирки с суспензией при 7 тыс. об/мин 30секунд. Максимально удалить супернатант, используя отдельный наконечник для каждой пробы.

10. Поместить пробирки с открытыми крышками в термостат на 60^оС на 10-15 минут до полного испарения жидкости (сорбент должен стать белым).

11. К сухому осадку в пробирках добавить по 100 мкл Реагента №8, перемешать на вортексе. Инкубировать 5 минут при температуре +60^оС, перемешивая каждые 2 минуты. Центрифугировать суспензию при 12-14тыс. об/мин 2 минуты. Чистую надосадочную жидкость (около 70 мкл) рекомендуется отобрать, не захватывая сорбент, в новые пробирки объемом 0,5 или 1,5 мл.

ВНИМАНИЕ: В ИНСТУКЦИИ К НАБОРУ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ВОЗМОЖНЫ ИЗМЕНЕНИЯ. НЕОБХОДИМО ЗАРАНЕЕ ВНИМАТЕЛЬНО ИЗУЧИТЬ ИНСТРУКЦИЮ!!!

7.2. Качественное определение ГМО

Для данной процедуры используется «Растение/35S+FMV/NOS скрининг» - тест-система для обнаружения ГМО растительного происхождения, рассчитанная на 100 реакций, включая контрольные образцы.

Тест-система «Растение/35S+FMV/NOS скрининг» предназначена для обнаружения генетически модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения в продуктах питания, пищевом сырье и кормах для животных методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).

Тест-система «Растение/35S+FMV/NOS скрининг» рекомендована для применения при анализе любых образцов, в том числе многокомпонентных.

Тест-система «Растение/35S+FMV/NOS скрининг» показывает присутствие всех возможных линий ГМО без их идентификации.

7.2.1. Состав набора

1. Реакционная смесь «Растение-35S-FMV-NOS-ВПК» 550 мкл, 4 пробирки;

2. SynTaq ДНК-полимераза, 5 ед/мкл 50 мкл, 1 пробирка;

3. «ПКО-С1», положительный контрольный образец 100 мкл, 1 пробирка;

4. «ОКО», отрицательный контрольный образец 200 мкл, 1 пробирка;

Условия хранения: не выше минус 18ºC

7.2.2. Список дополнительного оборудования

1. Прибор для ПЦР в реальном времени (АНК-32М, DTprime, iQ4/5, CFX-96, Rotor-Gene 6000, ABI Prism 7500),

2. Микроцентрифуга-встряхиватель, например, «Циклотемп-901»,

3. Микроцентрифуга для пробирок 0,2 мл, например, «Циклотемп-903»,

4. Штатив для микропробирок 0,2 мл,

5. Комплект дозаторов переменного объема и наконечников к ним,

6. Микропробирки объёмом 1,5 или 2,0 мл,

7. ПЦР-пробирки объёмом 0,2 мл.

7.2.3. Порядок исследования образцов

№ ячейки		Образец
АНК-32М, Rotor-Gene 6000	DTprime, iQ4/5, CFX-96, ABI Prism 7500
1	B 2	ПКО-С1
2	B 3	ПКО-С1
3	B 4	ОКО
4	B 5	ОКО
5	B 6	исследуемый образец 1
6	B 7	исследуемый образец 1
7	B 8	исследуемый образец 2
8	B 9	исследуемый образец 2
…	…	…

7.2.4. Подготовка к проведению реакции ПЦР-РВ

1. Разморозить необходимое количество пробирок с реакционной смесью «Растение-35S-FMV-NOS-ВПК» (каждая пробирка рассчитана на постановку 26 реакций), выдержать 15 минут при комнатной температуре, перемешать на вортексе и центрифугировать в течение нескольких секунд для сброса капель.

2. В отдельной пробирке подходящего размера смешать:

21*(2N+4) мкл реакционной смеси «Растение-35S-FMV-NOS-ВПК»

0,5*(2N+4) мкл Taq ДНК-полимеразы,

где N – количество исследуемых образцов.

Полученную смесь перемешать на вортексе и центрифугировать в течение нескольких секунд. Разлить полученную смесь по 20 мкл в пробирки объёмом 0,2мл.

3. ПКО, ОКО и исследуемые образцы разморозить, перемешать на встряхивателе и центрифугировать.

Примечание: Если образец ДНК содержит сорбент, центрифугировать образцы 1минуту при 10-14 тыс. об./мин. до полного осаждения сорбента.

4. Внести в подготовленные пробирки по 5 мкл ОКО, исследуемых образцов и, в последнюю очередь, ПКО в двух повторах (см. п. «Порядок следования ДНК образцов»), используя наконечники с аэрозольным барьером, плотно закрыть крышки и центрифугировать пробирки несколько секунд.

5. Поместить пробирки в амплификатор в порядке, приведенном в п. «Порядок следования ДНК образцов».

7.2.5. Рекомендуемые условия проведения ПЦР

АНК-32М: Протокол «Раст/35S/NOS»

Номер ступени	Температура, 0С	Время, сек	Кол-во циклов	Метки циклов
1	95	300	1
2	60	40	50	Начало
3	95	15	50	Конец

DTprime: Протокол «GMO-60»

Цикл	Повторы	Шаг	Время, мин:сек	Температура, 0С	Детекция
1	1	1	05:00	95,0
2	50	1	00:15	95,0
		2	00:40	60,0	Включена

 

iQ4/5, CFX-96: Протокол «GMO-59»

Cycle (цикл)	Repeats (повторы)	Step (шаг)	Dwell time (время, мин:сек)	Setpoint (температура, 0С)	Камера
1	1	1	05:00	95,0
2	45	1	00:15	95,0
		2	00:40	59,0	Включена

Rotor-Gene 6000: Протокол «Screening»

Шаг	Темп., ºC	Время	Детекция	Красители	Повторов
Hold	94	3 mins	No acquiring		1
Cycling	94	15 secs	No acquiring		45
	59	50 secs	Acquiring	JOE/ Yellow ROX/ Orange FAM/ Green Cy5/ Red

ABI Prism 7500: Протокол «GMO-60»

Stage 1 (Стадия 1)	Stage 2 (Стадия 2)
Reps (Повторов) – 1 95 оС – 5:00	Reps (Повторов) – 45 95 оС – 0:15 60 оС – 0:40

SmartCycler: Dye Set «FTTC25»

Протокол «GMO-60»

Stage 1 (Стадия 1)			Stage 2 (Стадия 2)
Hold			Repeat (Повторы) – 50 times
			2-Temperature Cycle
Temp., ºC	Secs	Optics	Deg/Sec	Temp., ºC	Secs	Optics
94.5	300	Off		95.0 60.0	15 40	Off On

7.2.6.Реакции и цветовые каналы прибора

Растение – канал R6G / HEX /JOE / Yellow

Промотор 35S+FMV – канал ROX / TxRed / Orange

Терминатор NOS – канал FAM / Green

ВПК– канал Cy5 / Red

7.2.7.Шаблон для обработки результатов

«Растение-35S+FMV-NOS скрининг.xlt»

7.2.8. После окончания реакции отработанные пробирки утилизировать в соответствии с рекомендациями по организации ПЦР лаборатории.

7.2.9. С помощью программного обеспечения прибора для ПЦР-РВ произвести расчет и сохранение значений пороговых циклов Ct кинетических кривых проведенной реакции для трех красителей – FAM (NOS-терминатор), ROX (35S-промотор) и Cy5 (ВПК).

7.2.10. Скопировать рассчитанные значения Ct в шаблон файла для автоматического анализа результатов в программе Excel (табл. 4).

При необходимости распечатать.

Таблица 4. Файл автоматического анализа результатов качественного определения ГМО.

Обнаружение ГМО
Дата	дд.мм.гг
Файл	nn.nn.nn.nn
№	Название	NOS	35S	ВПК	Ct (FAM)	Ct (ROX)	Ct (Cy5)
1	ПКО	33,02	34,75		33,69	35,06	>50,00
2	ПКО				32,35	34,44	>50,00
3	ОКО	-	-	31,15	>50,00	>50,00	30,75
4	ОКО	-	-		>50,00	>50,00	31,56
5	Образец 1	+	+	+	28,43	30,14	30,98
6	Образец 1	+	+	+	28,47	30,5	30,45
7	Образец 2	+	+	-	28,69	30,93	>50,00
8	Образец 2	+	+	-	28,84	31,27	>50,00
9	Образец 3	+	-	+	28,43	>50,00	29,85
10	Образец 3	+	-	+	28,47	>50,00	29,79
11	Образец 4	+	-	-	28,43	>50,00	>50,00
12	Образец 4	+	-	-	28,47	>50,00	>50,00
13	Образец 5	-	-	+	>50,00	>50,00	29,85
14	Образец 5	-	-	+	>50,00	40,19	29,79
15	Образец 6	-	-	-	37,97	39,67	>50,00
16	Образец 6	-	-	-	>50,00	>50,00	>50,00

ВНИМАНИЕ: В ИНСТУКЦИИ К ТЕСТ-СИСТЕМЕ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГМО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ВОЗМОЖНЫ ИЗМЕНЕНИЯ. НЕОБХОДИМО ЗАРАНЕЕ ВНИМАТЕЛЬНО ИЗУЧИТЬ ИНСТРУКЦИЮ!!!

7.2.11. При исследовании пищевой продукции или продовольственного сырья, содержание любого количества ГМО в которых запрещено действующим Законодательством, то на данном этапе исследование прекращается и заполняется заключение (Приложение 3).

7.3. Количественное определение ГМО

Количественное определение ГМО проводится при исследовании пищевой продукции или производственного сырья, содержание ГМО в которых в определённом количестве разрешено действующим Законодательством.

Реактивы поставляются в готовом виде в пробирках для ПЦР объемом 0,2 мл и требуют только внесения образца ДНК.

7.3.1. Взять необходимое количество пробирок с реакционной смесью из тест-систем для количественного анализа ГМО ( «Тест-система для определения процентного содержания ДНК ГМ сои Roundup Ready линии GTS 40-3-2» или «Тест-система для определения процентного содержания ДНК ГМ кукурузы MON 810») из расчета 2*N+8, где N-количество анализируемых образцов. Не допускать размораживания и повторного замораживания оставшихся пробирок со смесью.

7.3.2. После размораживания реакционной смеси, центрифугировать пробирки 30-60 секунд (скорость вращения ротора более 4000 об./мин. или 2500g). Для этого воспользоваться либо ротором для пробирок 0.2 мл, либо адаптерами к стандартному ротору для пробирок 2.0 мл.

7.3.3. Маркировать пробирки. Для приборов, производящих измерение через крышку пробирки, маркировку наносить на стенку пробирки; для приборов, производящих измерение через стенку пробирки – на крышку.

7.3.4. Калибровочные образцы (КО) ДНК ГМО и исследуемые образцы разморозить, перемешать на встряхивателе и центрифугировать.

7.3.5. Внести в пробирки под масло по 2 мкл исследуемых образцов и, в последнюю очередь, калибровочных образцов ГМ сои или кукурузы в двух повторах, используя наконечники с аэрозольным барьером, перемешать многократным пипетированием (5-10 раз) и плотно закрыть крышку. Следить, чтобы в смеси не оставалось пузырьков воздуха. При образовании пузырьков центрифугировать пробирки 3-5сек.

7.3.6. Поместить пробирки в амплификатор в порядке, приведенном в табл.5.

Таблица 5. Порядок следования образцов при количественном анализе.

7.3.7. Задать программу амплификации (табл. 6 и 7), выбрать соответствующие каналы детекции (табл. 8) и запустить прибор в соответствии с инструкцией.

Таблица 6. Программа амплификации для количественного анализа ГМ сои GTS 40-3-2.

№ цикла	Температура	Время	Кол-во циклов	Оптика
1	95оС	10 минут	1
2	95оС	20 секунд	50
	62оС	50 секунд		включена
3	25оС	Хранение

 

Таблица 7. Программа амплификации для количественного анализа ГМ кукурузы MON 810.

№ ступени	Температура	Время	Кол-во циклов	Оптика
1	95оС	10 минут	1
2	95оС	20 секунд	50
	60оС	50 секунд		включена
3	25оС	Хранение

 

Таблица 8. Каналы детекции.

Реакция	Краситель	Длина волны поглощения/ испускания	Подходящие для измерения каналы прибора
Соя / кукуруза	R6G	520 / 550	R6G, JOE, HEX, TET
ГМвставка	FAM или ROX	490 / 520	FAM, SYBR Green I
		580 / 605	ROX, Tx. Red

 

7.3.8. После окончания реакции отработанные пробирки утилизировать в соответствии с рекомендациями по организации ПЦР лаборатории.

7.3.9. С помощью программного обеспечения прибора для ПЦР-РВ произвести расчет и сохранение значений пороговых циклов Ct кинетических кривых проведенной реакции для двух красителей – R6G (ДНК сои или кукурузы) и FAM/ROX, в зависимости от типа прибора (ГМ вставка).

7.3.10. Скопировать рассчитанные значения Ct в шаблон файла для автоматического анализа результатов в программе Excel (рис. 1). При необходимости распечатать.

Рис.1. Файл автоматического анализа результатов количественного определения ГМ сои.

ВНИМАНИЕ: В ИНСТУКЦИИ К ТЕСТ-СИСТЕМЕ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГМО РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ВОЗМОЖНЫ ИЗМЕНЕНИЯ. НЕОБХОДИМО ЗАРАНЕЕ ВНИМАТЕЛЬНО ИЗУЧИТЬ ИНСТРУКЦИЮ!!!

8. Интерпретация результатов

 

8.1. Качественное определение ГМО

8.1.1. Результатом эксперимента является качественное выявление ДНК ГМО в ПКО, ОКО и исследуемых образцах (табл.4).

8.1.2. Критерием достоверности полученных результатов является выполнение ВСЕХ ниже перечисленных условий:

- пороговый цикл (Ct FAM) для ПКО NOS-терминатора < 37;

- пороговый цикл (Ct ROX) для ПКО 35S-промотора < 37;

- результат определения ОКО отрицательный, пороговый цикл (Ct Cy5) для внутреннего положительного контроля в ОКО < 37.

8.1.3. В случае обнаружения ГМО в ОКО результат анализа всех проб нельзя считать достоверным. Требуется предпринять меры по выявлению источника контаминации и повторить анализ проб.

8.1.4. Определение ДНК 35S-промотора и NOS-терминатора в исследуемых образцах проводится автоматически путем сравнения исследуемых образцов и ПКО, в котором содержится менее 100 копий/мкл ДНК 35S-промотора и NOS-терминатора.

8.1.5. Интерпретацию результатов анализа следует проводить в соответствии с таблицей 9.

Таблица 9. Интерпретация результатов анализа

Результат ПЦР по			Интерпретация
NOS	35S	ВПК
+	-	+	Обнаружен NOS-терминатор
+	-	-
-	+	+	Обнаружен 35S-промотор
-	+	-
+	+	+	Обнаружен 35S-промотор и NOS-терминатор
+	+	-
-	-	+	Не обнаружены 35S-промотор и NOS-терминатор
-	-	-	Ложноотрицательный результат, в образце присутствуют ингибиторы ПЦР. Рекомендуется развести образец в 5 раз TE-буфером (Реактив №9 из набора для выделения ДНК) и повторить определение. Для количественного исследования такогообразца также рекомендуется братьразбавленную ДНК.

 

8.2. Количественное определение ГМО

8.2.1. Результатом эксперимента является построение калибровочной прямой, расчет ее параметров и определение процентного содержания ГМО в исследуемых образцах.

8.2.2. Критерием достоверности построенной калибровочной прямой является выполнение ВСЕХ ниже перечисленных условий:

- коэффициент корреляции R2 более 0,97 (см. параметры калибровочной прямой на графике);

- коэффициент А калибровочной прямой лежит в диапазоне от 0,25до 0,35.

8.2.3. Результаты, полученные для исследуемых образцов, считаются достоверными только в том случае, когда выделилось достаточное для анализа количество ДНК исследуемого растения. Анализ достоверности полученных результатов проводят по схеме:

Случай А : выделилось достаточное количество ДНК для определения любых процентных содержаний ГМО. Результаты расчёта принимаются.

Случай Б : образец содержит недостаточное количество ДНК для точного расчета процента ГМО. Результаты расчёта считаются приблизительными и принимаются только в случае обнаружения больших содержании ГМО (> 10%). Для получения более точных данных рекомендуется повторить амплификацию, взяв 5 мкл образца, или выделить ДНК из нескольких навесок образца, объединить и сконцентрировать.

Случай В : образец содержит недостаточное количество ДНК для точного определения процента ГМО. Результаты расчёта считаются недостоверными. Для получения более точных данных рекомендуется повторить амплификацию, взяв 5 мкл образца, или выделить ДНК из нескольких навесок образца, объединить и сконцентрировать

Случай Г : в образце не обнаружено искомой растительной ДНК.

9. Утилизация отходов

9.1. Пробирки после выделения ДНК утилизируются как обычные твердые отходы.

9.2. Пробирки с продуктами ПЦР и использованные наконечники к микродозаторам подвергаются первичной обработке растворами, вызывающими деградацию ДНК.

10. Источники появления ложноположительных результатов при проведении ПЦР-анализа и их предотвращение

Наиболее мощные источники загрязнений (в порядке вклада):

- загрязнение продуктами предыдущих реакций;

- загрязнение положительным контролем (клонированная ДНК или сырье);

- перекрестное загрязнение образцов;

- загрязнение из других источников при взятии образцов (возможно даже загрязнение от перчаток).

10.1. Для предотвращения появления ложноположительных сигналов необходимо соблюдать требования по организации лаборатории и правила работы персонала с оборудованием и реактивами.

10.2. Необходимо предотвращать возможность загрязнений, происходящих вне лаборатории – во время сбора образцов и их первичной обработки (фасовка, упаковка, транспортировка).

10.3. На этапах выделения ДНК и постановки ПЦР необходимо постоянно использовать в работе отрицательные контроли.

10.4. Для повышения точности анализа исследования должны выполняться не менее, чем в двух повторах (исследовать от одного образца сразу две пробы).

10.5. В случае получения постоянных положительных сигналов на отрицательных контролях все исходные реактивы немедленно заменить и провести мероприятия по деконтаминации.

11. Приложение 1

Алгоритм лабораторного исследования образца пищевой продукции.

12. Приложение 2

Схема лабораторного исследования образца пищевой продукции.

13. Приложение 3.

«Утверждаю»

зав. лабораторией

___________ _________________

^{(подпись) (ФИО)}

«____» _____________ 20 ___ г.

Протокол

лабораторных исследований методом РВ-ПЦР на содержание генетически модифицированных организмов (ГМО)

№ ______ от «____» _____________ 20___ г.

1.Наименование заказчика: _______________________________________________________________

2. Дата отбора образцов: _ _________________________________________________

3. Дата поступления образцов в лабораторию: _______________________________________________

4. НД на метод исследований: _____________________________________________________________

5. НД на продукцию: ____________________________ ___________________________________

6. Результаты исследований:

7.Заключение: ____________________________________________________________________ ______

8. Ф.И.О., должность лица, проводившего исследования ______________________________________

_______________________________________________________________________________________

9. Подпись ________________________

14. Литература

1. ГОСТ ИСО 21569-2009 «Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Методы качественного обнаружения на основе анализа нуклеиновых кислот».

2. ГОСТ ИСО 21570-2009 «Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производственных продуктов. Количественные методы, основанные на нуклеиновой кислоте».

3. ГОСТ ИСО 21571-2009 «Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и производственных продуктов. Методы экстрагирования нуклеиновых кислот».

4. Международный стандарт ИСО 24276-2013 «Методы анализа для обнаружения генетически модифицированных организмов и полученных из них продуктов. Общие требования и определения».

5. МеждународныйстандартИСО 21568-2009 «Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products - Sampling».

6. Технический регламент «Требования к безопасности пищевой продукции, полученной из генно-модифицированных растений и животных», Постановление Правительства Республики Казахстан от 21 сентября 2010 года.

7. Ермишин, А.П., Холмецкая, М.О. Некоторые организационные и методические подходы повышения эффективности детекции генетически модифицированных составляющих в пищевых продуктах // Тез. докл. конф./под ред. Н.А.Жагоры. – Минск: БелГИМ, 2008, С. 101-104.

8. Шнеер, В.С.ДНК-штрихкодирование видов животных и растений – способ их молекулярной идентификации и изучения биоразнообразия // Журнал общей биологии, 2009. № 4. С. 296-315.

9. Heinze, B. A database of PCR primers for the chloroplasts genomes of higher plants // Plant Molecular Biology, 1991.V.17.Issue 5. P. 1105-1109.

10. Taberlet, P., Gielly, L., Pautou, G., Bouvet, J. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA // Plant Methods, 2007.3:4 doi: 10 1186/1746-4811. P.3-4.

11. Wang, X-R., Tsumura, Y., Yoshimaru, H., Nagasaka, K., Szmidt, A. E. Phylogenetic relationships of Eurasian pines (Pinus, Pinaceae) based on chloroplast rbcl, matK, rpl20-rps18 spacer, and tmV intron sequences // American Journal of Botany, 1999. V.86. P. 1742-1753.

12. Mullis, K., Faloona, F., Scharf, S., Saiki, R., Horn. G., and Erlich, H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction // Erlich Cold Spring Harbor Symp Quant Biol, 1986. 51:263-273.

13. Маниатис, Т., Фритч, Э., Сэмбрук, Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М.: Мир, 1984. С. 159-172.

14. Методические рекомендации «Качественное и количественное определение генетически модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения в продуктах питания и пищевом сырье», ЗАО «Синтол», Москва 2006